曹诗林
,
徐培
,
马永正
,
姚潇晓
,
姚远
,
宗敏华
,
李雪辉
,
娄文勇
催化学报
doi:10.1016/S1872-2067(16)62528-7
催化剂是化学工业的重要基础，其中酶是重要的高效天然催化剂。近年来，酶被越来越多地应用于工业领域，如精细化工、食品工业、制药工业、纺织业和制浆造纸。然而，由于游离酶存在价格昂贵及操作稳定性(特别是回收与重复使用性能)低等缺点，其在工业上的进一步应用受到一定限制。对酶进行固定化是解决上述问题的有效途径。一个理想的酶固定化技术需要载体具有良好的生物相容性和高比表面积，能够负载适量的酶并且具有很好的重复使用性能，固定化酶的过程简单温和，所得到的固定化酶制剂具有良好的催化性能、稳定性以及工业应用价值。尽管固定化酶技术经过了多年的发展，但仍需进一步研究。近几年，人们研究了基于纤维素纳米晶类、聚多巴胺类纳米载体以及生物相容性合成有机物纳米胶等新型载体对酶的固定化，取得了较好的成果。本文综述了这些新型纳米载体的制备以及酶的固定化过程，阐述了纳米载体固定化酶的结构和催化性能，并展望了发展前景。纤维素是全球产量最高、来源最广的生物聚合物。纤维素经过一定的酸(常用硫酸和盐酸)水解处理后，剩下的是具有高结晶度的纤维素纳米晶。它具有高比表面积、高机械强度和高长径比等优异性能。因此，研究者利用纤维素纳米晶作为载体进行酶固定化，获得了高负载量、高催化性能的固定化酶制剂。基于仿生矿化法制备的聚多巴胺类材料近年来获得研究者越来越多的关注。多巴胺具有良好的自聚合能力，可以对无机、有机等各种材料进行表面修饰。同时，聚多巴胺中含有的活性官能团可以与酶发生交联，从而达到固定化酶的效果。基于合成性聚合物纳米胶载体的固定化酶技术同样是一个新兴的、有意义的研究领域。相关的固定化过程可分为两大类：(1)在酶分子表面通过原位聚合生成纳米胶(growing-from过程)；(2)将酶与预先合成的纳米胶进行交联(grafting-to过程)。其中， growing-from过程是先将酶分子丙烯酰化，再进行原位聚合。而原位聚合又可分为自由基聚合、原子转移自由基聚合(ATRP)和可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)。其中， ATRP和 RAFT主要用于制备环境响应型的酶-聚合物纳米凝胶。
关键词:
酶固定化
,
纤维素纳米晶
,
聚多巴胺
,
生物相容性材料
邓啸
,
曹诗林
,
李宁
,
吴虹
,
ThomasJ. Smithd
,
宗敏华
,
娄文勇
催化学报
doi:10.1016/S1872-2067(15)61045-2
脂肪酶是一种三酰基甘油水解酶,目前广泛用于油脂化学、食品、有机合成和生物医药等领域.但是,游离脂肪酶在有机反应体系中容易失活,难以从反应体系中回收,导致其循环利用困难和生产成本增加.因此,需要对游离脂肪酶进行固定化,提高酶的稳定性和重复使用性,使其能够大规模用于工业生产.
磁性四氧化三铁纳米粒子(MNPs)具有其超顺磁性和大比表面积等性质,但MNPs需表面修饰才能进一步应用.近年来,仿生矿化法制备的聚多巴胺纳米材料受到人们关注.在仿生矿化过程中,单体多巴胺经自聚合作用后形成聚多巴胺,该反应活性高,能对各类有机和无机纳米材料进行表面修饰.而且,聚多巴胺表层中的活性基团能与含有氨基和巯基的生物大分子发生迈克尔加成或席夫碱反应,从而将生物大分子固定在材料表面.
本文利用聚多巴胺表面修饰MNPs,对所得聚多巴胺表面修饰的四氧化三铁纳米粒子(PD-MNPs)进行了结构表征.结果表明, PD-MNPs尺寸在14 nm左右.同时,成功将黑曲霉脂肪酶(ANL)固定在PD-MNPs上,结果显示在pH=8、固定化时间为12 h条件下,酶负载量为138 mg/g,酶活回收率达到83.6%,而且固定化酶的pH稳定性及热稳定性、储藏稳定性都优于游离酶.动力学研究表明,固定化酶Km值(63.2 mmol/L)低于游离酶(74.5 mmol/L),固定化酶的底物亲和性增强.进一步研究了固定化酶和游离酶在乙腈、二甲基亚砜、乙醇和[HMIm]BF4这四种溶剂中的溶剂耐受性,结果显示固定化酶的耐受性均强于游离酶.采用红外光谱对游离酶和固定化酶二级结构的分析表明,游离黑曲霉脂肪酶经固定化后,α-螺旋和β-折叠含量分别增加了0.84%和2.74%,使得固定化后α-螺旋和β-折叠中存在的氢键能够更好地保持酶结构刚性,避免因结构改变而引起酶失活,增强了固定化酶在溶剂中的耐受性.
二氢杨梅素是一种具有类黄酮结构的天然产物,具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤和保护肝脏等作用,但其脂溶性很差,很难透过细胞膜被人体吸收.本课题组曾首次以乙酸乙烯酯为酰基供体,采用游离脂肪酶生物催化方法成功将二氢杨梅素酰化.本文考察了PD-MNPs固定化脂肪酶在二氢杨梅素酰化反应中的应用.结果表明,与游离酶相比,固定化酶在反应介质二甲基亚砜中的耐受性更强,反应48 h后其催化二氢杨梅素酰化的转化率接近80%,明显好于游离酶(69%).固定化酶催化二氢杨梅素酰化的最适底物摩尔比、温度和酶量分别为10：1(乙酸乙烯酯：二氢杨梅素)、45oC,和40 U.此外,固定化酶在外界磁场作用下能迅速从反应混合物中分离,从而可回收利用,在重复使用10次后,其活性仍保持在初始活性的55%以上,具有良好的工业应用前景.
关键词:
磁性四氧化三铁
,
纳米粒子
,
聚多巴胺
,
黑曲霉脂肪酶
,
二氢杨梅素
,
酰化
张媛媛
,
宗敏华
,
娄文勇
,
林颖敏
,
吴虹
催化学报
基于在反应体系中添加碳酸氢铵可有效地促进酶促外消旋对羟基苯甘氨酸甲酯不对称水解这一有趣现象的发现,探讨了利用有机介质中酶促外消旋对羟基苯甘氨酸甲酯不对称水解制备对映体纯D-对羟基苯甘氨酸及其衍生物的可能性,研究了不同来源的酶、摇床转速、水含量、对羟基苯甘氨酸甲酯浓度、反应介质及温度等因素对该反应的影响. 结果表明,在所研究的11种酶中脂肪酶Novozym 435对该反应的催化活性和对映体选择性较高,叔丁醇为最合适的反应介质,最适水含量为0.4%(V/V),对羟基苯甘氨酸甲酯的适宜浓度为20 mmol/L,最适摇床转速和反应温度分别为130 r/min和30 ℃. 在此优化条件下反应26 h后,底物转化率和产物ee分别为39.8%和95.2%.
关键词:
脂肪酶,Novozym 435,对羟基苯甘氨酸甲酯,不对称水解,D-对羟基苯甘氨酸,有机介质
李颖
,
胡双岚
,
程建华
,
娄文勇
催化学报
doi:10.1016/S1872-2067(14)60005-X
酸性离子液体具有催化活性好、选择性高及易于回收等优点,是一种应用前景非常好的环境友好的酸性催化剂,在生物柴油合成反应中具有重大的理论意义和应用价值.本文以油酸和甲醇为原料,探讨了7种不同酸性离子液体在生物柴油合成反应中的催化效应.研究表明,离子液体酸性越强,催化酯化活性越高；引入磺酸基团可大大增强离子液体Br?nsted酸性,使其在酯化反应中发挥溶剂/催化剂的双重作用,促进酯化反应向产物方向进行,达到高产率,因而1-丁基磺酸-3-甲基咪唑硫酸氢盐([BHSO3MIM]HSO4)催化效果最好.此外,系统研究了[BHSO3MIM]HSO4催化油酸与甲醇酯化反应,并采用响应面法优化了反应条件.结果发现,该反应的最适醇酸摩尔比、催化剂用量、反应温度及反应时间分别为4：1,10%(基于油酸的质量),130 oC和4 h；在此条件下,生物柴油产率为97.7%.[BHSO3MIM]HSO4连续使用10批次后,仍能保持初始催化活性的95.6%,表现出极好的操作稳定性.另外,利用该离子液体催化游离脂肪酸含量为72%的废油脂生产生物柴油,反应6 h可获得产率94.9%.可见,[BHSO3MIM]HSO4在酯化生产生物柴油方面具有巨大的应用潜力.
关键词:
酸性离子液体
,
生物柴油
,
油酸
,
甲醇
,
酯化
娄文勇
,
郭强
,
郁惠蕾
,
宗敏华
催化学报
采用近平滑假丝酵母细胞用于催化乙酰基三甲基硅烷不对称还原反应,可高选择性地生成(R)-1-三甲基硅乙醇.结果表明,固定化于海藻酸钙的细胞催化该反应的产物收率比游离细胞的高.不同辅底物对该反应的影响显著,以葡萄糖为辅底物时,反应的初速率较快,产物收率较高.该反应的最适条件为:辅底物(葡萄糖)浓度110mmol/L,振荡速度180 r/min,缓冲液pH值6.0,反应温度30℃,底物浓度20mmol/L.在此反应条件下反应的仞速率、产物收率和产物的ee值分别为11.4μmol/h,96.5%和99.9%.
关键词:
近平滑假丝酵母细胞
,
乙酰基三甲基硅烷
,
(R)-1-三甲基硅乙醇
,
不对称还原
李南薇
,
吴虹
,
宗敏华
,
娄文勇
催化学报
采用吸附法对来源于扩展青霉Penicillium expansum的脂肪酶进行了固定化. 从20种不同来源的树脂中筛选出固定化效率高且价格低廉的D4020树脂作为载体,系统研究了固定化条件对固定化效率及固定化酶转酯活力的影响. 结果表明,最适加酶量、缓冲液pH和吸附时间分别为0.7 g/g、 9.4和4 h. 冻干时添加0.5%的半乳糖有助于提高固定化酶的转酯活力. 在上述优化条件下,固定化酶的转酯活力为404.0 U/g, 而所用的游离酶不能催化该转酯反应. 利用该固定化酶催化玉米油转酯反应生产生物柴油时,叔戊醇为适宜的反应介质,其最适添加量为0.5 ml/g;适宜的酶量、加水量和反应温度分别为60.6 U/g、油重的1.2%和35 ℃. 按醇/油摩尔比为1的比例分别在反应0、 2和 6 h 时加入甲醇,在优化反应条件下,反应 24 h 后甲酯产率达85.0%;固定化脂肪酶具有较好的操作稳定性,反应10批次时,相对酶活力为62.8%.
关键词:
扩展青霉脂肪酶
,
固定化
,
生物柴油
,
玉米油
,
甲醇
,
转酯反应
陈文静
,
娄文勇
,
王晓婷
,
宗敏华
催化学报
doi:10.3724/SP.J.1088.2011.10606
研究了有机溶剂/缓冲液双相体系中绿豆环氧化物水解酶高立体选择性地催化外消旋环氧苯乙烯水解生成(R)-苯基乙二醇反应.结果表明,与单水相反应体系相比,有机溶剂/缓冲液双相反应体系不仅有效地抑制环氧苯乙烯的非酶水解反应,而且明显提高底物的浓度,产物的收率和ee值更高.在所考察的不同有机溶剂中,正己烷不仅能较好地溶解底物,而且对酶的毒性较小,从而导致反应的初速率较快,产物的收率和ee值较高,是最适宜有机相.在两相体积比(正己烷/缓冲液)为1:1,底物浓度为20 mmol/L,缓冲液pH=6.5以及35℃的最适反应条件下,反应的初速率、产物的收率和ee值分别为5.42 mmol/(L·h),49.2％和94.3％.
关键词:
绿豆环氧化物水解酶
,
环氧苯乙烯
,
(R)-苯基乙二醇
,
有机溶剂/缓冲液双相体系
,
不对称水解
娄文勇
,
蔡俊
,
段章群
,
宗敏华
催化学报
doi:10.3724/SP.J.1088.2011.10711
以廉价的纤维素为原料,经不完全炭化和磺化制得含高密度(1.69 mmol/g) SO3H基团的固体酸催化剂Cellulose-SO3H.结果表明,该催化剂适宜的制备条件为:在400℃炭化15h,再在150℃磺化15h.所得催化剂在油酸与甲醇的酯化反应中表现出明显高于其它几种典型固体酸催化剂(铌酸,Amberlyst- 15,硫酸化氧化锆)的活性,同时还能高效地催化棕榈酸或硬脂酸以及高酸值废油脂(较多脂肪酸)与甲醇的酯化反应.在醇/油摩尔比为25,催化剂用量为10％(基于废油脂的质量),于85℃反应10h的条件下,生物柴油收率约为95％,明显高于上述三种典型固体酸催化剂.连续使用30批次(每批次10 h)后,Cellulose-SO3H仍能保持初始催化活性的90％以上,表现出极好的操作稳定性.可见,所制Cellulose-SO3H催化剂在生物柴油领域具有较好的应用潜力.
关键词:
纤维素
,
固体酸催化剂
,
生物柴油
,
酯化
,
废油脂
郭潇潇
,
徐培
,
宗敏华
,
娄文勇
催化学报
doi:10.1016/S1872-2067(17)62787-6
甲壳素,又名几丁质(chitin),是自然界中含量仅次于纤维素的第二大天然多糖,有第六生命要素之美称.其主要存在于甲壳类动物的外壳、真菌细胞的细胞壁以及一些昆虫的外壳中,每年自然界中约有100多亿吨甲壳素生成.甲壳素是由2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖和2-氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成的二元线性聚合物,分子链中分布许多羟基、氨基及乙酰氨基,形成大量分子间及分子内氢键,致使其结晶度较高,化学性质十分稳定,直接利用较为困难.甲壳素不溶于稀酸、稀碱以及一般有机溶剂,工业上常用强酸强碱法处理甲壳素,以制备壳寡糖类产品,但该方法具有产品结构不单一,环境污染较为严重等缺点.甲壳素酶可特异性水解甲壳素链中β-1,4糖苷键,得到甲壳寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖.酶解法降解甲壳素工艺简单、反应条件温和、环境友好,有很好的应用前景.我们以Paenibacillus pasadenensis CS0611为出发菌株,以蟹壳粉末为培养基唯一碳源及氮源,在适宜条件下培养48 h.发酵液经离心、硫酸铵(80％饱和度)盐析、透析除盐后得到粗酶液.再利用HiTrap DEAE FF离子交换层析和HiLoad 26/600Superdex 200 pg凝胶过滤层析对该粗酶液进行分离纯化,以得到电泳纯甲壳素酶.所制备甲壳素酶比活力为10.28 U/mg,最终纯化倍数为5.3,酶活得率为15.7％.SDS-PAGE结果表明,该甲壳素酶相对分子质量约为69 kDa.后经MALDI-TOF-MS鉴定,该酶部分肽段和来源于另一株Paenibacillus pasadenenss的甲壳素酶(accession No:gi655151624)具有较高的同源性,进一步证实所纯化蛋白为甲壳素酶.对上述纯化的甲壳素酶的酶学性质进行研究,结果发现:其最适反应温度为50℃,在20-35℃内有较好的稳定性,50℃及以上热稳定性较差;最适pH为5.0,在pH4.0-11.0间具有较高稳定性,表明该酶具有很好的耐碱性;金属离子对该酶催化活性没有明显的激活作用,表明该甲壳素酶是非金属酶.同时,对该酶的底物特异性进行研究,发现该酶对胶体甲壳素和甲壳素水解能力较强,对淀粉和纤维素无水解能力,对不同脱乙酰度的壳聚糖的水解程度随脱乙酰度不同而变化,表明该酶只能特异性识别并降解GlcNAc-GlcNAc之间的糖苷键;以胶体甲壳素为底物时,米氏常数Km为4.41 mg/mL,最大反应初速度为1.08 mg/min.利用薄板层析和高效液相色谱对酶解产物进行分析,结果表明该甲壳素酶对胶体甲壳素的降解产物主要是(GlcNAc)2.综上所述,本研究所涉甲壳素酶在甲壳二糖的酶法制备方面具有较好的应用前景.
关键词:
甲壳素酶
,
分离纯化
,
酶学性质
,
类芽孢杆菌属
吴虹
,
宗敏华
,
娄文勇
催化学报
探讨了无溶剂系统中固定化脂肪酶Novozym 435催化餐饮业废油脂转酯生产生物柴油. 反应副产物甘油可吸附在固定化酶载体表面,采用丙酮洗涤除去甘油可提高酶的稳定性. 适宜的醇/油摩尔比、酶用量、反应温度和摇床转速分别为1, 6.6 U/g, 35～40 ℃和150 r/min,不宜加水到反应体系中. 采用分步加入甲醇的方式可减轻甲醇对酶的毒害作用. 分别在反应进行到6和14 h时用丙酮除去酶表面的甘油,然后按醇/油摩尔比为1的比例加入甲醇继续反应,反应30 h后产物中的脂肪酸甲酯含量为88.6%. 连续反应300 h后,酶活性基本没有下降.
关键词:
脂肪酶
,
固定化酶
,
废油脂
,
转酯反应
,
生物柴油
,
无溶剂系统
