王继峰
,
赵新元
,
赵焱
,
马成
,
钟儒刚
,
钱小红
,
应万涛
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2013.04041
蛋白质的还原-烷基化是蛋白质酶切中的重要步骤,常用的烷基化试剂是碘乙酰胺(IAA),但是IAA除了和半胱氨酸发生反应,也可能和其他多种氨基酸发生副反应.我们模拟常规的酶切条件,系统地研究了蛋白质真实酶切时所有酶切肽段发生烷基化的情况.结果表明,多种氨基酸可以发生烷基化,其趋势为:半胱氨酸＞肽段N端氨基酸＞天冬氨酸＞谷氨酸＞组氨酸＞天冬酰胺＞赖氨酸＞酪氨酸,同时也发现同一肽段上的氨基酸烷基化具有排他性和聚集性.根据定性结果,采用质谱多反应监测(MRM)技术对多个肽段进行了定量分析,评估了过烷基化对蛋白质定量分析的影响.该研究结果表明,过量的烷基化修饰对蛋白质的定性与定量分析都可能产生较大影响.在蛋白质组学研究的样本处理流程中,应避免样本的过烷基化.
关键词:
液相色谱
,
质谱
,
多反应监测
,
蛋白质组学
,
烷基化
,
碘乙酰胺
金祖耀
,
吕雅瑶
,
周珊珊
,
郝斐然
,
付斌
,
应万涛
,
钱小红
,
张养军
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2015.01036
为了实现蛋白质组的深度覆盖，特别是低丰度蛋白质的定性鉴定和定量分析，目前常用的方法是采用更长或装填更小粒径填料的毛细管色谱柱，但因此带来的问题是色谱柱反向柱压显著升高。针对以上问题发展了一种简单的毛细管色谱柱电加热装置制作方法，并将该装置安装于液相色谱-质谱联用系统，分别以牛血清白蛋白（ BSA）酶切肽段混合物和酵母蛋白（ yeast）酶切肽段混合物为样品，从柱压和柱效两方面对该装置的性能进行了评价。实验结果表明，所制作的毛细管柱电加热装置安装在装填粒径为3μm 反相色谱填料的毛细管柱上，在最佳电流（100 mA）下对 BSA及 yeast酶切肽段混合物进行分离时的柱压比不加电流时的柱压降低至少50％，柱效略有升高。这说明所制作的毛细管色谱柱电加热装置能显著降低柱压，为在较低的柱压条件下选择更小粒径色谱颗粒填料的毛细管色谱柱提供了一种有效的方法。
关键词:
毛细管高效液相色谱-串联质谱
,
蛋白质组学
,
电加热装置
,
柱压
,
柱效
张养军
,
王京兰
,
李蕾
,
应万涛
,
蔡耘
,
钱小红
色谱
doi:10.3321/j.issn:1000-8713.2004.01.006
在蛋白质组学研究中,多肽混合物的有效分离对蛋白质鉴定和蛋白质之间相互作用的研究起着决定性的影响.基于此,用反相液相色谱研究了在两个不同长度的色谱柱上分离多肽混合物时色谱柱长度与峰容量的关系,同时考察了梯度洗脱时间对峰容量和峰宽的影响.实验结果表明,色谱柱长度对峰容量有显著的影响,而延长梯度洗脱时间不仅可以增加峰容量,而且可以增加峰宽.这说明用毛细管液相色谱-串联质谱联用方法对多肽混合物进行分离鉴定时,采用较长的色谱柱和较长的梯度洗脱时间有利于对更多的多肽进行分析鉴定.
关键词:
反相液相色谱
,
色谱柱长度
,
峰容量
,
多肽
,
蛋白质组学
郑兆彬
,
应万涛
,
蔡耘
,
田中民
,
钱小红
色谱
doi:10.3321/j.issn:1000-8713.2007.06.003
复杂肽段混合物的有效分离是高覆盖率地鉴定蛋白质混合物的前提.Shotgun蛋白质组学研究通常采用二维液相色谱(强阳离子交换色谱-反相色谱)分离后接串联质谱检测的方法.但由于离子交换色谱体系中含有高浓度的盐,使得在线分析的难度较大;而在离线分析时,也常因需要对高盐组分进行脱盐处理而易引起样品损失.因此,该文尝试用pH梯度替代盐梯度,实现pH梯度-强阳离子交换色谱方法应用于复杂肽段混合物的分离.通过对缓冲体系pH值的计算,优化了乙酸-乙酸铵体系线性pH梯度配合盐梯度的离子交换色谱方法,以及柠檬酸-氨水体系线性pH梯度的离子交换色谱方法.将这两种方法应用于牛血清白蛋白酶切产物的分离取得了与常规强阳离子交换色谱相似的分离效果.乙酸-乙酸铵体系采用的是低浓度的可挥发性铵盐,采用真空冻干的方法可以有效除盐,基质辅助激光解吸质谱靶上自然挥发也可以达到较好的脱盐效果,简化了常规方法繁琐费时的脱盐步骤及避免了由此造成的样品损失.柠檬酸-氨水体系采用pH梯度洗脱替代盐梯度洗脱,大大降低了体系中的盐浓度.这两种方法在复杂体系蛋白质组研究的样本预分离中具有较好的应用前景.
关键词:
离子交换色谱
,
缓冲体系
,
pH梯度
,
肽段分离
米薇
,
王晶
,
应万涛
,
贾伟
,
蔡耘
,
钱小红
色谱
多维色谱分离、串联质谱分析技术已在蛋白质组研究中得到广泛应用.然而生物样品的蛋白质以及全酶切肽段具有高度的复杂性,这严重干扰了蛋白质高通量、规模化的分析.通过标签肽段富集进行样品预分离可以降低体系的复杂程度.本文建立了一种基于共价色谱技术选择性分离富集含半胱氨酸肽的方法,从而降低了样品体系的复杂程度.首先以牛血清白蛋白(BSA)的酶切肽段为模型,对富集条件进行了优化和考察,并在此基础上通过5种蛋白质酶切肽段混合物的富集对该方法进行了验证.结果证明此方法的重现性好,富集效率高,富集特异性好,能有效地富集鉴定含半胱氨酸肽段.所建立的方法在复杂体系的蛋白质组研究中具有广泛的应用前景,为复杂样品的蛋白质高通量、自动化、规模化鉴定和定量研究提供了实用技术.
关键词:
共价色谱
,
液相色谱-串联质谱
,
含半胱氨酸肽
,
富集
,
蛋白质组
林威
,
王京兰
,
应万涛
,
钱小红
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2012.04027
为了提高二氧化钛富集磷酸肽法对磷酸肽的富集效率,以6种标准蛋白酶切肽段混合物为研究对象,对二氧化钛富集磷酸肽过程中的乙腈比例、三氟乙酸比例、二氧化钛用量等条件分别进行了优化.结果表明在乙腈含量为80％ (v/v),三氟乙酸含量为1％(v/v),二氧化钛用量与需要富集肽段的质量比为40∶1的条件下,可以取得较好的富集效果.将优化后的富集方法应用于腾冲嗜热厌氧菌磷酸化蛋白质的分析,初步鉴定到25个磷酸化蛋白质,为进一步研究这种极端环境下生存的低等生物的生命活动提供了参考信息.
关键词:
液相色谱
,
质谱
,
二氧化钛
,
磷酸肽
,
富集
,
腾冲嗜热厌氧菌
,
蛋白质组
马成
,
潘一廷
,
张琪
,
王继峰
,
钱小红
,
应万涛
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2013.05043
蛋白质的N-糖基化是最重要的翻译后修饰之一,许多已知的血浆肿瘤诊断标志物及治疗靶标都是N-糖基化蛋白.针对血浆的糖蛋白质组研究有利于发现新的蛋白标志物.然而,血浆蛋白质浓度分布的动态范围非常宽,且同一位点上的糖链存在微观不均一性,影响了血浆中糖蛋白的鉴定效率.本文利用亲水材料ZIC-HILIC制备亲水富集柱分别对人血浆中的N-糖链和N-糖肽进行富集,并结合碱性反相色谱进行肽段的预分离和高准确度质谱分析,最终在健康人的血浆中鉴定到了299个糖基化蛋白、637个糖基化位点,并识别出31种不同的糖型.在这些鉴定到的糖基化位点中,新发现有107个N-糖基化位点(占总位点数的16.8％).本方法操作简单,可以有效富集N-糖肽和N-糖,为在血浆中寻找糖蛋白和糖链生物标志物提供了可靠的手段.
关键词:
超滤辅助样品制备
,
亲水相互作用色谱
,
反相色谱
,
N-糖基化蛋白
,
N-糖
李贤煜
,
赵新元
,
应万涛
,
钱小红
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2013.02010
分泌蛋白质组(secretome)是指在特定的时空条件下,细胞、组织等分泌的全部蛋白质.分泌蛋白质组可能包含了大量的疾病诊断生物标志物,因此其相关研究越来越受到重视.分泌蛋白质组的组成高度复杂且浓度范围宽,这对分析方法提出了挑战.建立有效的蛋白质或肽段预分离策略,将有利于分泌蛋白质的高覆盖率鉴定.本研究以肝癌细胞系MHCC97L的无血清培养分泌蛋白质为研究对象,采用一种新型等电聚焦预分离(OFFGEL)系统,考察了肽段水平的分级对蛋白质鉴定结果的影响.结果表明,分离后各馏分中肽段的等电点分布与理论预测基本一致,每个馏分中单独鉴定的肽段比例接近80％,显示了该系统对肽段的高分辨分离能力结合生物质谱技术,在肝癌细胞分泌系统中鉴定了 2995个蛋门质,显示了该系统在复杂体系蛋白质组研究中的应用潜力.
关键词:
等电聚焦
,
预分离
,
分泌蛋白质组
,
分级
,
鉴定
,
肝癌细胞
