卢庄
,
王京兰
,
贾伟
,
杨兵
,
蔡耘
,
邓玉林
,
张玉奎
,
钱小红
色谱
doi:10.3321/j.issn:1000-8713.2009.01.003
蛋白质的糖基化是最重要的翻译后修饰之一,与蛋白质结构和功能的关系密切.凝集素亲和色谱是蛋白质糖基化研究中很常用的工具,不同的凝集素可以对不同的单糖或寡糖有特异的富集作用.麦胚凝集素(WGA)由于其特异作用的糖型广泛存在而成为使用最多的凝集素之一.在本研究中,发现将WGA用于糖肽亲和富集会导致部分肽段的降解,从而导致后续的肽段序列分析的失败.本文用4种标准蛋白质对这种现象进行了验证,结果表明肽段的降解可以发生在多个位点,其中较多地发生在酪氨酸、苯丙氨酸及亮氨酸的羧基端.这一结果提示:在糖蛋白质组研究中,如果应用WGA富集糖肽并采用质谱进行鉴定,则采用半酶切或非特异性酶切的检索策略更为合适.
关键词:
麦胚凝集素亲和色谱
,
糖肽
,
肽键
,
断裂
,
蛋白质组学
迟明
,
毕炜
,
卢庄
,
宋丽娜
,
贾伟
,
张养军
,
钱小红
,
蔡耘
色谱
二氧化钛富集法作为目前使用最为广泛的金属氧化物富集磷酸肽的方法,在富集过程中常常对富含天冬氨酸和谷氨酸的酸性非磷酸化肽段存在一定的非特异性吸附作用.这些肽段与磷酸化肽段一同被富集,降低了磷酸肽富集的选择性.传统方法中使用的非特异性吸附抑制剂常会对质谱的电喷雾离子源造成污染,因而限制了其在液相色谱-质谱联用(LC-MS)系统中的应用.本研究将天冬氨酸作为一种新型的非特异性吸附抑制剂加入到二氧化钛富集体系中,并分别对3种和9种标准蛋白质酶切肽段混合物进行富集实验,同时与添加另一种非特异性吸附抑制剂--谷氨酸以及不添加任何非特异性吸附抑制剂的富集体系进行了富集效果的比较.结果表明,天冬氨酸可以有效地提高二氧化钛对磷酸肽富集的选择性.将添加天冬氨酸的二氧化钛富集体系应用于鼠肝全蛋白质磷酸肽的富集中,同样取得了很好的效果,表明天冬氨酸在复杂的生物样本的磷酸肽富集中也同样具有良好的应用前景.此外,由于天冬氨酸在反相色谱中极易被洗脱去除,从而避免了传统抑制剂对LC-MS系统离子源的污染问题.
关键词:
二氧化钛
,
富集
,
非特异性吸附抑制剂
,
天冬氨酸
,
磷酸肽
,
鼠肝
马岩
,
张万军
,
卫军营
,
牛明
,
林虹君
,
秦伟捷
,
张养军
,
钱小红
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2011.00205
复杂肽段混合物的有效分离是高覆盖率地鉴定蛋白质混合物的前提."鸟枪法"(Shotgun)蛋白质组学研究策略通常采用蛋白酶切、二维液相色谱-串联质谱分析肽段混合物从而鉴定蛋白质,其中高效率地分离肽段混合物是关键步骤之一.本文通过pH梯度结合有机溶剂梯度的反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行一维液相色谱分离,按等时间间隔收集馏分并将一个梯度的前段的一个馏分与后段一个馏分混合,然后进行纳升级液相色谱-质谱联用(nanoRPLC-MS/MS)分析.将该方法应用于酵母蛋白质的分离和鉴定,实验结果为:与常规的强阳离子色谱-反相液相色谱-质谱分离鉴定方法相比,采用pH梯度结合有机相梯度的RP-HPLC-RPLC-MS分离鉴定方法多鉴定到567个酵母蛋白质(簇,含有3 035个唯一肽段);其中鉴定到肽段的pI分布范围为3.42～12.01,相对分子质量范围为587.67～3 499.79;蛋白质的pI分布范围为3.82～12.19,相对分子质量范围为3 446.55～432 905.该结果表明这种方法在复杂体系蛋白质组分离鉴定中具有明显的优势,在蛋白质组学研究中有较好的应用前景.
关键词:
反相高效液相色谱
,
pH梯度洗脱
,
有机溶剂梯度洗脱
,
纳升级反相高效液相色谱-串联质谱
,
肽混合物
,
酵母
毛心丽
,
卫军营
,
牛明
,
周廉淇
,
王雪颖
,
佟巍
,
秦伟捷
,
张养军
,
钱小红
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2011.11020
建立了依赖色谱保留时间的智能化选择反应监测质谱方法,并与非依赖色谱保留时间的智能化选择反应监测质谱分析方法对不同体系(牛血清白蛋白酶切物、6种标准蛋白质混合物酶切物、腾冲嗜热菌蛋白提取液酶切物)的分析结果进行了系统比较.结果表明,引入色谱保留时间后的智能化选择反应监测质谱方法能够显著提高肽段及蛋白质的鉴定量,并且在复杂体系(如腾冲嗜热菌蛋白提取液酶切物)中效果尤为明显,鉴定到的肽段及蛋白质的覆盖率可分别达到目标肽段和蛋白质数量的89.62％和92.41％,并且灵敏度高、重复性好,能够实现对质荷比相同但保留时间有差异的肽段的准确鉴定.该方法将在复杂生物样本目标蛋白质组高通量、高灵敏度的鉴定、验证和确认中发挥独特作用.
关键词:
液相色谱
,
保留时间
,
智能化选择反应监测
,
质谱
,
目标蛋白质组学
,
腾冲嗜热菌
白海红
,
范超
,
沈丙权
,
田芳
,
邓玉林
,
潘一廷
,
秦伟捷
,
钱小红
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2014.11022
蛋白质的 N-糖基化修饰与多种重要的生理、病理进程密切相关，是多种重大疾病诊断标志物研究的热点。由于糖蛋白本身多是低丰度表达的蛋白质，且糖链结构具有高度微不均一性，这使得蛋白质糖基化修饰的分析具有一定的挑战。本研究利用表面引发-原子转移自由基聚合（ SI-ATRP ）法，以带有双键的氨基葡萄糖为单体（GMAG），成功制备了新型核壳型亲水聚合物-硅胶杂化填料（pGMAG-SiO2）。由于在硅胶表面引入致密的亲水聚合物层，该填料不仅保持了硅胶良好的机械强度，而且显著提高了其亲水性，因此非常适合作为亲水填料用于蛋白质的N-糖链富集。以麦芽七糖和鸡卵清蛋白的N-糖链为研究对象，考察了该填料对N-糖链的富集效果，并将该杂化填料成功用于人血浆中糖蛋白 N-糖链的富集检测，共鉴定了47种糖型。以上结果表明，pGMAG-SiO2填料对N-糖链具有较高的亲和性，可以用于 N-糖链的高覆盖率鉴定。
关键词:
表面引发-原子转移自由基聚合反应
,
核壳型硅胶填料
,
N-糖链
,
N-糖基化蛋白质
金祖耀
,
吕雅瑶
,
周珊珊
,
郝斐然
,
付斌
,
应万涛
,
钱小红
,
张养军
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2015.01036
为了实现蛋白质组的深度覆盖，特别是低丰度蛋白质的定性鉴定和定量分析，目前常用的方法是采用更长或装填更小粒径填料的毛细管色谱柱，但因此带来的问题是色谱柱反向柱压显著升高。针对以上问题发展了一种简单的毛细管色谱柱电加热装置制作方法，并将该装置安装于液相色谱-质谱联用系统，分别以牛血清白蛋白（ BSA）酶切肽段混合物和酵母蛋白（ yeast）酶切肽段混合物为样品，从柱压和柱效两方面对该装置的性能进行了评价。实验结果表明，所制作的毛细管柱电加热装置安装在装填粒径为3μm 反相色谱填料的毛细管柱上，在最佳电流（100 mA）下对 BSA及 yeast酶切肽段混合物进行分离时的柱压比不加电流时的柱压降低至少50％，柱效略有升高。这说明所制作的毛细管色谱柱电加热装置能显著降低柱压，为在较低的柱压条件下选择更小粒径色谱颗粒填料的毛细管色谱柱提供了一种有效的方法。
关键词:
毛细管高效液相色谱-串联质谱
,
蛋白质组学
,
电加热装置
,
柱压
,
柱效
隋少卉
,
王京兰
,
卢庄
,
蔡耘
,
张养军
,
蔚文峰
,
钱小红
色谱
doi:10.3321/j.issn:1000-8713.2008.02.012
为了在短时间内获得相对含量高的磷酸化肽段,以标准磷酸化蛋白质为模型对强阳离子交换色谱(SCX)分离磷酸化肽段体系的缓冲溶液和梯度设置进行了研究,并用酵母酶切肽段混合物考察了该路线在较复杂的样品中的应用.实验结果表明优化后的体系能够在30 min内分离出磷酸肽段,而且非磷酸化肽段的干扰很少,这样便相对提高了磷酸化肽段在质谱仪中的响应强度,重要的是该体系可以对复杂样品进行很好的分离.这说明SCX用于规模化磷酸化肽段富集的策略是可行的.本研究为磷酸化蛋白质组学规模化分析提供了实用技术.
关键词:
磷酸化
,
位点
,
强阳离子交换色谱
,
富集
,
蛋白质组学
王继峰
,
赵新元
,
赵焱
,
马成
,
钟儒刚
,
钱小红
,
应万涛
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2013.04041
蛋白质的还原-烷基化是蛋白质酶切中的重要步骤,常用的烷基化试剂是碘乙酰胺(IAA),但是IAA除了和半胱氨酸发生反应,也可能和其他多种氨基酸发生副反应.我们模拟常规的酶切条件,系统地研究了蛋白质真实酶切时所有酶切肽段发生烷基化的情况.结果表明,多种氨基酸可以发生烷基化,其趋势为:半胱氨酸＞肽段N端氨基酸＞天冬氨酸＞谷氨酸＞组氨酸＞天冬酰胺＞赖氨酸＞酪氨酸,同时也发现同一肽段上的氨基酸烷基化具有排他性和聚集性.根据定性结果,采用质谱多反应监测(MRM)技术对多个肽段进行了定量分析,评估了过烷基化对蛋白质定量分析的影响.该研究结果表明,过量的烷基化修饰对蛋白质的定性与定量分析都可能产生较大影响.在蛋白质组学研究的样本处理流程中,应避免样本的过烷基化.
关键词:
液相色谱
,
质谱
,
多反应监测
,
蛋白质组学
,
烷基化
,
碘乙酰胺
时照梅
,
范超
,
黄俊杰
,
白海红
,
秦伟捷
,
蔡耘
,
钱小红
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2014.09037
生物体内蛋白质的糖基化修饰调控着细胞识别、细胞黏附和迁移以及免疫应答等多种生理过程,并与多种人类重大疾病的发生、发展密切相关.因此对蛋白质糖基化修饰的鉴定,不仅能够为生物学机理研究提供重要信息,对疾病诊断标志物和治疗靶标的发现也至关重要.然而在复杂生物体系中,大多数糖蛋白为低丰度蛋白质,其含量与现有质谱仪器的检测灵敏度之间存在较大差距,所以对含有不同糖型结构的糖蛋白进行全面/高效的富集,是实现高灵敏度糖蛋白鉴定的必由之路.凝集素富集作为一种有效的糖蛋白富集方法,已在糖蛋白质组学研究中得到了广泛的应用.针对现有凝集素功能化材料存在负载量偏低以及富集效率有限等问题,我们制备了两种以氧化石墨烯(GO)为载体的新型固定化凝集素,利用GO比表面积大,功能基团含量高,分散性、化学稳定性好等特点,实现了高负载量的凝集素固定(GO-ConA 2.073 mg/mg,RSD=1.0％;GO-WGA 1.908 mg/mg,RSD=0.14％).同时考察了材料的可重复使用性与稳定性:每隔3天测一次同一GO-lectin材料对对应糖蛋白的富集效果,可以看出材料合成两周内富集效果都＞200 μg/mg.将该GO-lectin成功应用于糖蛋白、糖肽的选择性富集,在糖蛋白质组学研究中体现出良好的应用潜力.
关键词:
凝集素
,
氧化石墨烯
,
富集
,
糖蛋白
,
糖肽
