马岩
,
张万军
,
卫军营
,
牛明
,
林虹君
,
秦伟捷
,
张养军
,
钱小红
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2011.00205
复杂肽段混合物的有效分离是高覆盖率地鉴定蛋白质混合物的前提."鸟枪法"(Shotgun)蛋白质组学研究策略通常采用蛋白酶切、二维液相色谱-串联质谱分析肽段混合物从而鉴定蛋白质,其中高效率地分离肽段混合物是关键步骤之一.本文通过pH梯度结合有机溶剂梯度的反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行一维液相色谱分离,按等时间间隔收集馏分并将一个梯度的前段的一个馏分与后段一个馏分混合,然后进行纳升级液相色谱-质谱联用(nanoRPLC-MS/MS)分析.将该方法应用于酵母蛋白质的分离和鉴定,实验结果为:与常规的强阳离子色谱-反相液相色谱-质谱分离鉴定方法相比,采用pH梯度结合有机相梯度的RP-HPLC-RPLC-MS分离鉴定方法多鉴定到567个酵母蛋白质(簇,含有3 035个唯一肽段);其中鉴定到肽段的pI分布范围为3.42～12.01,相对分子质量范围为587.67～3 499.79;蛋白质的pI分布范围为3.82～12.19,相对分子质量范围为3 446.55～432 905.该结果表明这种方法在复杂体系蛋白质组分离鉴定中具有明显的优势,在蛋白质组学研究中有较好的应用前景.
关键词:
反相高效液相色谱
,
pH梯度洗脱
,
有机溶剂梯度洗脱
,
纳升级反相高效液相色谱-串联质谱
,
肽混合物
,
酵母
毛心丽
,
卫军营
,
牛明
,
周廉淇
,
王雪颖
,
佟巍
,
秦伟捷
,
张养军
,
钱小红
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2011.11020
建立了依赖色谱保留时间的智能化选择反应监测质谱方法,并与非依赖色谱保留时间的智能化选择反应监测质谱分析方法对不同体系(牛血清白蛋白酶切物、6种标准蛋白质混合物酶切物、腾冲嗜热菌蛋白提取液酶切物)的分析结果进行了系统比较.结果表明,引入色谱保留时间后的智能化选择反应监测质谱方法能够显著提高肽段及蛋白质的鉴定量,并且在复杂体系(如腾冲嗜热菌蛋白提取液酶切物)中效果尤为明显,鉴定到的肽段及蛋白质的覆盖率可分别达到目标肽段和蛋白质数量的89.62％和92.41％,并且灵敏度高、重复性好,能够实现对质荷比相同但保留时间有差异的肽段的准确鉴定.该方法将在复杂生物样本目标蛋白质组高通量、高灵敏度的鉴定、验证和确认中发挥独特作用.
关键词:
液相色谱
,
保留时间
,
智能化选择反应监测
,
质谱
,
目标蛋白质组学
,
腾冲嗜热菌
李楠楠
,
周廉淇
,
毛心丽
,
张姣
,
卫军营
,
林虹君
,
李佳斌
,
田芳
,
张养军
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2013.03057
建立了定量肽段串联体蛋白质(concatamers of Q peptides,QconCATs)结合18O同位素标记-多反应监测质谱的蛋白质绝对定量新方法.首先对QconCAT重组蛋白质进行了纯度表征,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表征结果表明重组蛋白质的纯度在99％以上,相对分子质量约为63.4 kDa.对QconCAT重组蛋白质酶切后的肽段混合物进行质谱分析,并经pFind和pLabel软件处理,验证了目标肽段.还考察了QconCAT重组蛋白质的酶切效率和18O标记效率,并对QconCAT蛋白质结合18O标记-同位素稀释-多反应监测质谱方法进行了评价.实验结果表明,采用该方法对腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis,TTE)中选定蛋白质的肽段进行绝对含量测定时,相对标准偏差小于20％,准确度较高,说明该方法可用于复杂生物样本中蛋白质的绝对定量.更重要的是所建方法不仅解决了细胞培养氨基酸稳定同位素标记(SILAC)技术的重标试剂价格昂贵的问题,也为定量蛋白质组学提供了一种新的方法.
关键词:
定量肽段串联体蛋白质
,
同位素稀释
,
多反应监测质谱
,
18O标记
,
蛋白质组学
