陈曼
,
史键
,
王骊丽
,
耿信笃
色谱
doi:10.3321/j.issn:1000-8713.2006.05.015
建立了反相高效液相色谱分离、质谱定性、紫外检测定量测定康肾颗粒中葛根素含量的方法.采用YMC-ODS色谱柱(4.6 mm i.d.×100 mm,10 μm),选用甲醇(含0.1%三氟醋酸)和水(含0.1%三氟醋酸)体系为流动相,非线性梯度洗脱分离,流速1.0 mL/min,检测波长250 nm;用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析鉴定对照品和样品的馏分,在确定目标峰后进行紫外检测定量测定.结果表明,葛根素在0.132 ～1.32 μg范围内其峰面积与进样量呈良好的线性关系(r=0.999 7),平均加标回收率高于103%,相对标准偏差低于2.0%(n=6).应用该方法测定康肾颗粒中葛根素,其平均含量为3.09 mg/g.该方法简单、快速、重现性好.
关键词:
反相高效液相色谱法
,
基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱
,
紫外检测
,
葛根素
,
康肾颗粒
李瑛
,
白泉
,
陈刚
,
王骊丽
色谱
doi:10.3321/j.issn:1000-8713.2008.03.013
建立了疏水型色谱饼(10 mm×20 mm i.d.)与反相色谱(RPLC)离线二维色谱快速分离制备人血清蛋白质组学样品,并用基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进行检测的方法.以4种标准蛋白质的稀溶液为模型进行分离富集,得到细胞色素c(Cyt-c)与肌红蛋白(Myo)的检出限均为1 pmol/μL,溶菌酶(Lys)和胰岛素(Ins)的检出限为0.1 pmol/μL.将此方法用于人血清蛋白质组学样品的分离与制备,随着血清处理量的增大,质谱可检出的组分数目与信号强度均增加,当血清处理量达到 1.0 mL 时,可检出低丰度蛋白质或多肽285个(相对分子质量均在15 000以下).研究中将1 μg Cyt-c加入到0.5 mL血清中,用上述方法在分离富集低丰度Cyt-c上取得了很好的效果.结果表明,采用疏水型色谱饼与反相色谱联用技术不仅可对血清样品中低丰度蛋白质进行有效的分离和富集,而且一次样品的处理量大,可显著提高低丰度蛋白质的分析、检测水平.
关键词:
二维液相色谱
,
基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱
,
色谱饼
,
蛋白质组学
,
人血清
贾佳
,
王骊丽
,
高栋
,
耿信笃
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2010.00535
Flt3配体(FL)是一类具有促进早期造血功能的细胞因子,在促进造血细胞生长发育及造血动员方面具有重要的临床应用价值.为了用基因工程方法获得大量用于临床和研究的重组人FL(rhFL)蛋白质,本文对在大肠杆菌(E. coli)中表达得到的Flt3配体的包涵体进行回收、洗涤,溶解于8 mol/L 脲后在高效疏水相互作用色谱(HPHIC)柱上进行rhFL包涵体的复性与同时纯化,并对其保留特征和复性规律进行了研究.结果表明,在连续进样、变性蛋白质质量浓度为8.51 g/L、固定相选用端基为PEG800、流动相添加4 mol/L 脲、1.8 mmol/L 还原型谷胱甘肽(GSH)和0.3 mmol/L氧化型谷胱甘肽(GSSH)、pH 7.0的优化条件下,复性与同时纯化rhFL包涵体的质量回收率为36.9% ,纯度达94.5%以上.本文仅用一步HPHIC法成功地复性与同时纯化了rhFL蛋白质,为获得高活性的rhFL产品奠定了一定的工作基础.
关键词:
高效疏水相互作用色谱法
,
复性
,
纯化
,
重组人Flt3配体
,
包涵体
毕晶
,
白泉
,
王军
,
王骊丽
色谱
采用疏水相互作用色谱(HIC)对还原变性核糖核酸酶A (RNase A)在疏水性液-固界面上的复性进行了研究.详细讨论了流动相中脲的浓度、还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)的比例、流动相pH和变性蛋白质浓度对还原变性RNase A复性效率和质量回收率的影响.结果表明,在最优化的复性条件(流动相中含有2.0 mol/L 脲,GSH/GSSG的浓度比为8∶1,流动相pH为8.0)下,还原变性RNase A能完全复性.当变性蛋白质质量浓度为5.0 mg/mL 时,还原脲变性RNase A的活性回收率和质量回收率分别为98.0%和61.9% ,还原胍变性RNase A分别为100.1%和66.8% .研究表明HIC是还原变性蛋白质复性的有力工具之一,可为蛋白质复性研究提供新方法和新思路.
关键词:
蛋白质复性
,
疏水作用色谱
,
还原变性
,
核糖核酸酶A
王超展
,
王骊丽
,
耿信笃
色谱
doi:10.3321/j.issn:1000-8713.2007.04.014
用蛋白折叠液相色谱法(PFLC)对大肠杆菌表达的包涵体形式的重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)进行了复性并同时纯化.用Cu2+-亚氨基二乙酸(IDA)Sepharose作为固定化金属离子亲和色谱的固定相.在低浓度脲存在下,以咪唑为洗脱剂,采用线性梯度洗脱rhG-CSF.该法仅通过一步PFLC分离,减少了复性过程中rhG-CSF的聚集,复性后的rhG-CSF的比活性为1.8×108 IU/mg,纯度为97%,质量回收率为32%.
关键词:
固定化金属离子亲和色谱
,
蛋白折叠
,
纯化
,
重组人粒细胞集落刺激因子
,
大肠杆菌
王骊丽
,
王超展
,
耿信笃
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2011.00036
为了提高重组人干细胞因子(rhSCF)的复性效率,改进了高效疏水相互作用色谱(HPHIC)纯化和复性rhSCF的方法.首先将目标蛋白溶解于8.0 mol/L 脲中,然后将rhSCF包涵体的提取液直接进样到不同规格的HPHIC柱进行纯化和复性.优化了固定相配基结构和流动相组成等实验条件,结果表明,本方法可以快速地获得高质量回收率和高生物活性的rhSCF,rhSCF在40 min内即可完成复性与纯化,目标蛋白的纯度在95.5% 以上,质量回收率高于49.6% .通过体积排阻色谱和基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)的分析,确认rhSCF以单体存在.结果进一步证明HPHIC法是同时复性和纯化重组蛋白的有效工具.
关键词:
高效疏水相互作用色谱
,
重组人干细胞因子
,
包涵体
