吴丹
,
王超展
,
耿信笃
色谱
doi:10.3321/j.issn:1000-8713.2007.02.014
蛋白折叠液相色谱法(PFLC)用于变性蛋白质复性并同时纯化时对流动相组成及其洗脱条件的要求远较通常的液相色谱法高.用端基为PEG-200的高效疏水作用色谱固定相对重组人干扰素-γ(rhIFN-γ)进行纯化并同时复性,详细研究了流动相组成、梯度洗脱模式和流速对rhIFN-γ质量回收率和活性的影响.分别以3.0 mol/L(NH4)2SO4+0.05 mol/L KH2PO4(pH 7.0)和0.05 moL/L KH2PO4(pH 7.0)为流动相A和B,采用35 min非线性梯度洗脱时,所得rhlFN-γ的质量回收率最高.
关键词:
高效疏水作用色谱法
,
流动相组成
,
梯度洗脱模式
,
纯化
,
复性
,
质量回收率
,
重组人干扰素-γ
柯从玉
,
白泉
,
耿信笃
色谱
doi:10.3321/j.issn:1000-8713.2004.04.026
研制出一种简易型色谱柱并通过装填大颗粒的疏水色谱填料对色谱柱的性能进行了考察,该柱的外形和操作如同传统的液相色谱柱,但它却在生物大分子分离方面有着和高效液相色谱相似的分辨率.另外,只要给该柱装填合适的固定相,比如疏水相互作用色谱固定相,便可用于蛋白质的复性及同时纯化.实验考察了该色谱柱的结构、操作和性能,包括柱压、柱寿命及对蛋白质的分辨率等.以溶菌酶为模型蛋白质,实验测得其在初始浓度为50.0 g/L时的质量回收率和活性回收率分别为(96.6±1.3)%和(101.1±6.0)%.这种简易型色谱柱价格低廉、易操作,且可在低压条件下对蛋白质进行纯化,表明其在对蛋白质药物的大规模纯化和复性方面有着很大的应用潜力.
关键词:
液相色谱
,
柱技术
,
溶菌酶
,
蛋白质
,
复性
,
纯化
全妙华
,
曾雄智
,
皮建辉
,
邓梅春
,
梁宋平
色谱
doi:10.3321/j.issn:1000-8713.2007.04.011
应用芴甲氧羰基(Fmoc)固相方法化学合成了敬钊毒素-V(JZTX-V)分子N-端酪氨酸残基剪切体(Y1-JZTX-V),并且通过反相高效液相色谱和质谱对不同条件下的氧化复性结果进行监测,从而得到该剪切体的最佳氧化复性条件:0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液、pH 7.50、1 mmol/L还原型谷胱甘肽(GSH)、0.1 mmol/L氧化型谷胱甘肽(GSSG)、样品浓度为0.05 mg/L、复性温度为4 ℃.膜片钳电生理实验结果显示敬钊毒素-V剪切体Y1-JZTX-V对大鼠背根神经节(DRG)细胞上表达的河豚毒素不敏感型(TTX-R)与河豚毒素敏感型(TTX-S)钠电流均有抑制作用,其半数抑制浓度(IC50)分别为(160±2.5)nmol/L和(39.6±3.2)nmol/L.与天然的敬钊毒素-V相比,该剪切体对大鼠DRG细胞上的TTX-S钠电流的抑制作用基本一致,但对TTX-R钠电流的抑制作用却大大降低,表明敬钊毒素-V分子N-端的酪氨酸残基是一个与TTX-R钠通道结合活性相关的氨基酸残基.
关键词:
化学合成
,
敬钊毒素-V剪切体
,
复性
,
钠离子通道
吴丹
,
高栋
,
白泉
,
耿信笃
色谱
doi:10.3321/j.issn:1000-8713.2008.02.014
用聚乙二醇200疏水相互作用色谱固定相(PEG200-STHIC)分别在色谱柱和色谱饼上完成了一步复性并同时纯化来源于大肠杆菌(E.coli)表达的重组人干扰素-γ,(rhIFN-γ).为了能使色谱分离方法用于不同来源的rhlFN-γ的纯化,对rhIFN-γ在反相色谱、离子交换色谱、固定化镍离子亲和色谱上的保留行为也进行了研究.色谱柱纯化的rhIFN-γ收集液经排阻色谱除盐和冷冻干燥得到rhIFN-γ干粉.用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对rhIFN-γ干粉进行了测定,rhIFN-γ单体的相对分子质量为17184.0,二聚体的相对分子质量为34204.4.用细胞病变抑制法(CPEI)测定rhIFN-γ干粉的比活性为9.5×108IU/mg.用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定rhIFN-γ干粉的纯度高于95%.用色谱柱复性并同时纯化rhIFN-γ的质量回收率达到93.7%,纯度高于95%,比活性为4.3 x 107IU/mg.结果表明,采用PEG200-STHIC色谱柱复性并同时纯化rhIFN-γ是一种十分高效的方法.
关键词:
重组人干扰素-γ
,
蛋白折叠液相色谱法
,
高效疏水色谱
,
复性
,
纯化
贾佳
,
王骊丽
,
高栋
,
耿信笃
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2010.00535
Flt3配体(FL)是一类具有促进早期造血功能的细胞因子,在促进造血细胞生长发育及造血动员方面具有重要的临床应用价值.为了用基因工程方法获得大量用于临床和研究的重组人FL(rhFL)蛋白质,本文对在大肠杆菌(E. coli)中表达得到的Flt3配体的包涵体进行回收、洗涤,溶解于8 mol/L 脲后在高效疏水相互作用色谱(HPHIC)柱上进行rhFL包涵体的复性与同时纯化,并对其保留特征和复性规律进行了研究.结果表明,在连续进样、变性蛋白质质量浓度为8.51 g/L、固定相选用端基为PEG800、流动相添加4 mol/L 脲、1.8 mmol/L 还原型谷胱甘肽(GSH)和0.3 mmol/L氧化型谷胱甘肽(GSSH)、pH 7.0的优化条件下,复性与同时纯化rhFL包涵体的质量回收率为36.9% ,纯度达94.5%以上.本文仅用一步HPHIC法成功地复性与同时纯化了rhFL蛋白质,为获得高活性的rhFL产品奠定了一定的工作基础.
关键词:
高效疏水相互作用色谱法
,
复性
,
纯化
,
重组人Flt3配体
,
包涵体
肖厚荣
,
徐小龙
,
解永树
,
刘清亮
应用化学
doi:10.3969/j.issn.1000-0518.2005.01.003
研究了盐酸胍变性烟草多酚氧化酶后的复性.结果表明,在没有外加添加剂存在的条件下,最优的复性条件为:盐酸胍浓度为1.5 mol/L;适宜的酶浓度为1.5×10-4 g/mL;变性时间短(30 min);复性温度低(4 ℃),此时,复性收率最高达到63.36%.1.0 mol/L硫酸铵具有一定的促进烟草多酚氧化酶复性的作用,与此相比,100 μmol/L硫酸铜促进烟草多酚氧化酶复性的效果较大,硫酸铜和硫酸铵存在协同作用,联合使用可获得最高的烟草多酚氧化酶复性收率;β-环糊精对变性烟草多酚氧化酶的复性具有一定辅助作用,溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)可增强β-环糊精辅助变性蛋白质复性的作用.
关键词:
多酚氧化酶
,
复性
,
盐酸胍
,
β-环糊精
,
溴化十六烷基三甲基铵
